"DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE UN PROTOCOLO DE BAJO COSTO PARA LA DETECCIÓN DE MUTACIONES SOMÁTICAS EN LOS ONCOGENES KRAS, NRAS Y EGFR POR NGS"

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Categoría
Defensas
Fecha
Viernes, 14 de Junio de 2019 16:00
Lugar de reunión
Salón de actos IIBCE
Defensa de Tesis de Posgrado en Biotecnología.
 
Estudiante: Valentina Russo
Tutores: Juan Martín Marqués y Astrid Agorio
Tribunal: Gonzalo Greif, Pablo Smircich y Mauricio Cuello
Defensa: viernes 14/6 en salón de actos IIBCE a las 16hs
Título: "DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE UN PROTOCOLO DE BAJO COSTO PARA LA DETECCIÓN DE MUTACIONES SOMÁTICAS EN LOS ONCOGENES KRASNRAS EGFR POR NGS"
 
Resumen:

El cáncer es una de las principales causas de muerte en todo el mundo. Muchos enfoques terapéuticos contra esta enfermedad utilizan terapias dirigidas al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). EGFR participa en cascadas de señalización intracelulares implicadas en el desarrollo y progresión tumoral. Mutaciones somáticas activantes en el gen EGFR se asocian con un aumento significativo de la respuesta a los fármacos inhibidores de la actividad tirosin-kinasa de EGFR (EGFR-TKIs), utilizados normalmente en cáncer de pulmón. Por otro lado, mutaciones en los oncogenes que codifican para las proteínas KRAS y NRAS, protagonistas de la vía de EGFR aguas abajo, provocan la activación constitutiva de la vía, independientemente de la actividad de EGFR y, debido a esto, generan baja respuesta a las terapias con anticuerpos monoclonales anti-EGFR, utilizadas normalmente en cáncer colorrectal. La determinación de mutaciones somáticas en estos genes es importante para predecir la eficacia terapéutica de estas drogas y poder identificar aquellos pacientes que se beneficiarán de las mismas. La técnica comúnmente utilizada para la detección de mutaciones somáticas es la secuenciación Sanger, que cuenta con una sensibilidad del 15 al 25% [1-4]. Sin embargo, los avances tecnológicos de los últimos años generaron una técnica de secuenciación masiva, NGS (Next Generation Sequencing), la cual permite detectar las variaciones genómicas que se dan en el ADN de un tumor, de forma más automatizada que Sanger, en varias muestras a la vez y para diferentes genes blanco, en un único experimento, y con una sensibilidad entre el 2-10% [5, 6]. El objetivo de este trabajo fue generar un protocolo de NGS utilizando la plataforma Ion Torrent PGM™, que fuera eficiente, rápido y con un menor costo que el planteado por el proveedor de forma que sea competitivo con Sanger; así como optimizar la detección de variantes en las secuencias generadas, utilizando como modelo mutaciones somáticas en los oncogenes KRAS, NRAS EGFR.  Los resultados relevantes de este trabajo fueron la optimización de la extracción de ADN a partir de tejido FFPE (Formalin-fixed paraffin-embedded), la creación de un método de trazabilidad de muestras mediante STRs (Short Tandem Repeats), la adaptación y puesta a punto de una alternativa para la construcción de bibliotecas utilizando el kit NEBNext® Fast DNA Library Prep Set for Ion Torrent™ a partir de amplicones y por último, la validación del sistema al que se llegó. También se evaluaron tres software para el análisis de secuencias: Torrent Suite™ (Thermo Fisher Scientific), Sophia DMD® (Sophia Genetics) y CLC Genomics Workbench (Qiagen), y se comparó su performance. Con el sistema de NEB utilizado se logró una disminución de costos de 50% con respecto al sistema de Ampliseq y de 12% con respecto a la secuenciación Sanger, con una base de 8 muestras procesadas en paralelo, 2 veces por semana. En lo que respecta a la validación de la técnica se obtuvo un 99,5% de especificidad, 12% de sensibilidad (en muestras con 50 o más copias de genoma), 100% de repetibilidad y 100% de exactitud. Gracias a esta reducción en los costos se puede plantear a futuro la posibilidad de realizar un cambio de tecnología sin encarecer el diagnóstico final, siempre que exista un mínimo de 15 muestras por semana en el laboratorio.

 
 

Todas las fechas

  • Viernes, 14 de Junio de 2019 16:00

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